中科院化学研究所：冷冻诱导策略升级LNP递送

在mRNA疫苗与核酸治疗领域，脂质纳米颗粒（LNP）是实现核酸分子高效递送的核心载体，而脂质材料更是决定LNP递送效率与生物安全性的关键。但长期以来，mRNA的固有不稳定性导致LNP制剂需低温储存，冷冻-解冻（F-T）过程中产生的冰晶与渗透压应力，易引发LNP聚集、mRNA泄漏等问题，严重制约其应用落地。

中国科学院化学研究所的团队在《Nature Communications》发表研究，提出一种全新解决方案：利用冷冻浓缩现象，让甜菜碱类冷冻保护剂（CPA）主动融入LNP，不仅能维持制剂稳定性，更能显著增强mRNA递送效率。该研究为脂质材料的制剂优化提供了全新思路。

研究背景

mRNA对水解、氧化及酶解极为敏感，必须在零下温度储存以维持稳定性，临床常用的mRNA-1273、BNT162b2疫苗均采用蔗糖作为冷冻保护剂。但即使添加保护剂，冷冻-解冻过程仍存在两大核心问题：

• 物理稳定性破坏：冰晶形成与渗透压变化会导致LNP融合、聚集，破坏其球形结构与粒径均一性。

• 递送效率下降：LNP结构破坏会引发mRNA泄漏，同时内体逃逸能力减弱，最终导致靶细胞内mRNA表达效率大幅降低。

现有研究多聚焦于“被动稳定”LNP，而本研究的创新点在于：主动利用冷冻-解冻过程本身，让冷冻保护剂从“稳定剂”升级为“功能增强剂”，实现稳定性与递送效率的双重提升。

冷冻浓缩驱动BT-CPA融入LNP

研究者团队开发了由甜菜碱（betaine）和海藻糖（trehalose）组成的复合冷冻保护剂（BT-CPA），通过一系列实验证实：冷冻过程可诱导BT-CPA主动融入LNP内部，同时实现两大效果：① 维持LNP在冷冻-解冻后的结构完整性；② 增强LNP的内体逃逸能力，提升mRNA递送效率。

冷冻过程中，水分会形成冰晶，导致剩余液相中LNP与冷冻保护剂浓度急剧升高，这一现象被称为“冷冻浓缩”。该过程会在LNP膜两侧形成陡峭的浓度梯度，驱动甜菜碱和海藻糖通过脂质膜的瞬时缝隙（由冰晶机械应力与脂质相变引发）被动扩散进入LNP内部。

研究者通过质子核磁共振和高分辨质谱验证了这一机制：经冷冻-解冻处理的LNP+BT-CPA样品，在透析去除外部游离BT-CPA后，仍能检测到甜菜碱（特征峰3.28 ppm、3.83 ppm）和海藻糖（特征峰3.34 ppm等）的特征信号；而未经过冷冻-解冻的LNP+BT-CPA样品，几乎无BT-CPA封装。这表明冷冻是BT-CPA融入LNP的必要条件，而非简单的表面吸附。

BT-CPA的优化：浓度与配比的精准调控

为平衡稳定性与递送效率，研究者对BT-CPA的配比和浓度进行了系统优化：

1. 复合配比优化：单独使用25 mg/mL甜菜碱虽能维持LNP稳定性，但mRNA封装效率略低于87 mg/mL蔗糖；添加25 mg/mL海藻糖后（即BT-CPA：甜菜碱25 mg/mL + 海藻糖25 mg/mL），LNP经冷冻-解冻后粒径变化极小，mRNA封装效率稳定，且递送效率较单独甜菜碱组提升1.4倍，较新鲜LNP提升2.4倍。

2. 浓度阈值效应：当甜菜碱浓度从10 mg/mL提升至25 mg/mL时，mRNA递送效率显著升高；但进一步提升至75 mg/mL时，效率不再增加，因此25 mg/mL为最优浓度。

3. 冷冻-解冻循环次数优化：1-2次循环可提升递送效率，且不破坏LNP结构；6次循环则会导致LNP聚集、mRNA泄漏，效率下降，因此2次循环为最优条件。

BT-CPA增强mRNA递送：提升内体逃逸能力

研究者通过细胞实验和机制验证，明确了BT-CPA提升递送效率的核心路径：不影响细胞摄取，而是通过增强内体逃逸能力提升mRNA表达。

1. 细胞摄取无差异，内体逃逸显著增强：流式细胞术分析显示，经BT-CPA处理并冷冻-解冻的SM-102-LNP（BT-CPA-LNP）与新鲜SM-102-LNP的细胞摄取效率几乎一致（无统计学差异）；但共聚焦显微镜观察发现，BT-CPA-LNP组中，Cy5标记的mRNA（红色）与溶酶体标记物（绿色）的重叠度显著降低，Pearson相关系数（PCC）显著低于新鲜LNP组，表明内体逃逸能力显著增强。

2. 分子机制：甜菜碱的质子化介导膜融合：甜菜碱作为两性离子分子，在酸性内体环境中会发生质子化，转化为带正电的物质，与带负电的内体膜发生静电相互作用，促进膜融合。研究者通过膜融合实验验证了这一机制：使用NBD-PE和Rhod-PE标记的模型内体，当LNP与内体融合时，NBD的荧光会因FRET效应解除而增强；结果显示，BT-CPA-LNP组的NBD荧光强度显著高于新鲜LNP组，证实其膜融合能力更强。

3. 普适性验证：适配多种脂质：关键亮点在于，BT-CPA的增强效应并非局限于SM-102一种脂质，而是对多种临床常用可电离脂质均适用。研究者分别以ALC-0315、MC3等脂质为核心脂质制备LNP，经BT-CPA处理并冷冻-解冻后，所有LNP的mRNA递送效率均显著提升，且粒径均维持在200 nm以下，PDI＜0.2，证明该策略对不同LNP制剂具有广泛适配性。

体内验证：更强免疫反应与剂量节约优势

在C57BL/6小鼠体内实验中，BT-CPA-LNP展现出显著的体内优势：

• mRNA表达效率更高：肌内注射后4 h和24 h，BT-CPA-LNP组的荧光素酶表达强度分别是新鲜LNP组的2.3倍和1.7倍。

• 免疫反应更强：封装卵清蛋白mRNA（mOVA）的BT-CPA-LNP，在0.1 μg和1 μg两个剂量下，诱导的OVA特异性IgG抗体滴度均显著高于新鲜LNP组；ELISpot实验显示，其诱导的IFN-γ阳性CD4⁺和CD8⁺ T细胞数量也显著更多。

• 长期稳定性优异：在-80 °C储存6个月后，BT-CPA-LNP仍能维持较高的mRNA表达效率，且细胞毒性极低（各浓度下DC2.4细胞存活率均＞90%）。

研究意义

研究的突破不仅在于提出了一种新型LNP冷冻保护策略，更颠覆了行业对“冷冻保护剂”的认知——冷冻保护剂不再是单纯的“稳定剂”，而是可通过冷冻过程主动融入LNP，成为调控其功能的“活性成分”。

该研究具有三大核心价值：

1.优化制剂储存方案：解决了LNP低温储存与运输中的稳定性难题，为mRNA疫苗和核酸药物的全球化配送提供了技术支撑。

2.拓展核心脂质应用场景：证实SM-102、ALC-0315、MC3等脂质材料可通过BT-CPA策略进一步提升递送效率，为其在癌症免疫治疗、罕见病基因治疗等领域的应用提供了优化方向。

3.创新制剂研发思路：开创了“利用冷冻过程实现功能增强”的制剂设计理念，为后续LNP制剂的创新研发提供了全新范式。

结语

中科院化学研究所的这项研究，通过对冷冻过程的精准利用，成功将LNP的“储存痛点”转化为“功能亮点”，为SM-102、ALC-0315、MC3等核心脂质材料的制剂优化提供了极具应用价值的技术方案，这将为更多疾病治疗带来新希望。

 

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Reference：

Cheng X, Zheng X, Tao K, et al. Freezing induced incorporation of betaine in lipid nanoparticles enhances mRNA delivery[J]. Nature Communications, 2025, 16(1): 4700.

 

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